Hyppiviä geenejä voidaan hyödyntää työkaluina molekyylibiologiassa/ Jumping genes can be utilized as molecular tools

Written by Katja
19
Aug

Elsi Pulkkinen

Kirjoittaja Elsi Pulkkinen on tohtorikoulutettava Turun Yliopiston Genetiikan ja Fysiologian osastolla ja hänen transpositioreaktiota hyödyntävien menetelmien kehittämiseen ja tehostamiseen keskittyvä väitöskirjansa on tällä hetkellä esitarkastuksessa. Vapaa-ajalla hän viihtyy luonnossa ja koiraharrastusten parissa.

The writer Elsi Pulkkinen is a PhD-student at the University of Turku at the section of Genetics and Physiology. She has studied the establishment and enhancement of Mu in vitro DNA transposition applications, and her PhD-thesis is currently at the pre-publication examination. On her spare time, she enjoys outdoor life and different dog sports.

Hyppiviä geenejä voidaan hyödyntää työkaluina molekyylibiologiassa

Hyppiviä geenejä, eli transposoneja, on kaikissa organismeissa: bakteereissa, kasveissa ja eläimissä. Ne voivat muodostaa huomattavan osan genomista, esimerkiksi ihmisen genomista noin 45 prosenttia on peräisin liikkuvista elementeistä. Suurin osa ihmisen genomissa sijaitsevista transposoneista on kuitenkin niin kutsuttuja molekulaarisia fossiileja, eli ne ovat ajan kuluessa menettäneet kykynsä liikkua. Transposonit voivat liikkuessaan muuttaa genomia ja joissain tapauksissa myös kasvattaa sen kokoa ja nykyisin ajatellaankin yleisesti että transposoneilla on ollut merkittävä rooli genomien muutoksessa ja lajien evoluutiossa.

Transposonien luontaista kykyä liikkua genomissa paikasta toiseen voidaan hyödyntää monipuolisesti eri tarkoituksiin, kuten geeninsiirtoon ja genomien muokkaukseen. Transposoneja on helppo muokata ja niihin perustuvia työkaluja käytetään sekä bakteereilla, kasveilla, selkärangattomilla, että selkärankaisilla. Mu on bakteriofagi joka hyödyntää omassa elinkierrossaan transpositioreaktiota ja sen transpositioreaktio pystytään toistamaan koeputkessa, eli in vitro. Väitöskirjatyöni tavoitteena oli kehittää uusia Mu:n transpositioreaktioon perustuvia menetelmiä molekyylibiologian työkaluiksi ja tutkia Mu:n transpositioreaktion tehokkuuden parantamista muokkaamalla transpositioreaktiossa tarvittavasta MuA proteiinista eri versioita.

Transposonien päissä on erityiset DNA-alueet joihin transpositioreaktiossa tarvittava proteiini sitoutuu, mutta päiden väliin voidaan sijoittaa lähes mitä tahansa DNA:ta.  Jotta erilaisten transposonien aktiivisuutta, eli sitä miten tehokkaasti ne insertoituvat haluttuun kohde DNA:han, voitaisiin mitata helposti ja vertailukelpoisesti, kehitin työssäni uuden menetelmän joka soveltuu kaikkien transposonien aktiivisuuden mittaamiseen. Työssäni todistin menetelmän toimivuuden erilaisten Mu-transposonien avulla ja osoitin että menetelmä antoi vertailukelpoisia tuloksia erilaisissa olosuhteissa, kuten vaihdeltaessa käytettävän transposoni-DNA:n määrää.

Rengasmuotoista DNA:ta on luonnossa runsaasti, niin elävien solujen sisällä, kuin myös solujen hajoamisen myötä vapautuneena erilaisiin ympäristöihin. Esimerkkejä rengasmuotoisesta DNA:sta ovat mitokondrioiden ja kloroplastien genomit, plasmidit, kromosomista peräisin olevat DNA-renkaat ja joidenkin virusten genomit. Rengasmuotoista DNA:ta on paljon, mutta sen tutkimus saattaa olla hankalaa sillä usein sen eristäminen riittävissä määrin ja riittävän puhtaana tuottaa ongelmia. Toinen työssäni kehitetty uusi menetelmä mahdollistaa periaatteessa minkä tahansa rengasmaisen DNA:n monistamisen ja säilyttämisen Escherichia coli –soluissa. Työssäni kehitetty menetelmä perustuu Mu:n in vitro transpositioreaktioon, jonka avulla tutkittaviin DNA-renkaisiin viedään DNA:n monistamisessa tarvittava replikaation aloituskohta ja antibioottivalinnan mahdollistava merkkigeeni. Menetelmä mahdollistaa pelkästään rengasmuotoisen DNA:n valitsemisen, jolloin mahdollisesti näytteessä olevat lineaariset DNA fragmentit eivät monistu, sekä sen että haluttua DNA rengasta saadaan tuotettua riittäviä määriä tutkimuksia varten.

Useimpien liikkuvien elementtien transpositiotehokkuus luonnossa on melko matala, sillä kovin tehokas liikkuminen saattaisi tuhota isännän nopeasti ja täten tuhota myös itse elementin. Transpositioreaktion tehokkuuden parantaminen eri molekyylibiologian käyttötarkoituksia varten onkin ollut yksi transpositiotutkimuksen tärkeimmistä tavoitteista. Työssäni kehitettiin Mu:n käyttämästä MuA proteiinista hyperaktiivisia muotoja ja osoitettiin että muokattujen proteiinien avulla voitiin parantaa erilaisten Mu:n transpositioon perustuvien menetelmien tehokkuutta huomattavasti.

Transposonit ovat tärkeässä asemassa kehitettäessä uusia turvallisia ja tehokkaita geeninsiirtovektoreita geeniterapiaa varten. Työssä kehitetyt hyperaktiiviset MuA-proteiinit parantavat merkittävästi jo olemassa olevien Mu:n transpositioon perustuvien menetelmien käytön tehokkuutta, mutta niistä on mahdollisesti hyötyä myös geeniterapiaan liittyvien sovellusten kehityksessä. Lisäksi työssä saatuja tuloksia voidaan hyödyntää myös tutkittaessa muita samankaltaisia proteiineja, kuten HI-viruksen integraasia.

Transposoneihin liittyviä menetelmiä kehitetään koko ajan lisää, ja vaikka niitä hyödynnetään vielä tällä hetkellä laajimmin bakteereilla ja selkärangattomilla, vaikuttaa siltä että tulevaisuudessa transposoniteknologioita tullaan käyttämään yhä enenevissä määrin myös selkärankaisilla.

Lue aiheesta lisää:

Jumping genes can be utilized as molecular tools

Jumping genes, or transposons, have been found in all organisms: bacteria, plants, and animals. They can make up a large proportion of a genome, for instance, 45 % of the human genome originates from mobile DNA. Most transposon insertions in genomes are molecular fossils, which mean that they are incapable of further movement. Movement and accumulation of transposons shape the genes and genomes and thus influence the evolution of their host.

The natural capacity of transposons to move from one location on the genome to another can be utilized for a number of different purposes, such as gene delivery and genome modification. Custom-designed transposons are easy to generate, and they have been widely used as molecular tools in the study of prokaryotes, plants, invertebrates, and also vertebrates. Mu is a bacteriophage, which uses transposition during its lifecycle. Transposition reaction of Mu can be conducted in a test tube, in vitro, which has enabled the establishment of a wide variety of Mu-based genetic tools. In my doctoral studies, my aim was to establish novel Mu transposition-based molecular genetics tools and to study the enhancement of Mu transposition reaction.

Mu transposition is mediated by a DNA transposition complex, the Mu transpososome, which is assembled when four transposase proteins bind to sequence-specific binding sites at each transposon end. In the first part of my thesis, I established a novel assay for monitoring the activity of transposition complexes. This assay is applicable to all types of transposons that have a functional in vitro reaction, and allows the direct comparison of transpositional activities within or between particular experimental systems.  In this study, we demonstrated the functionality of the assay with a set of Mu-based transposons, and showed that the assay yielded a linear response for example as a function of transposon DNA concentration.

Circular DNA is abundant in nature, and such circles exist within living cells and, due to cell decay, also as free DNA in various environments. Typical examples of DNA circles include mitochondrial and chloroplast genomes, chromosome-derived extrachromosomal circular DNA (eccDNA), viral genomes, and plasmids. However, studies on DNA circles are often hampered by difficulties in isolating high-quality circular DNA that would not contain linear fragments as contaminants.  In the second part of my thesis, I developed a new method that will potentially allow the “rescuing” of any circular DNA and maintaining it in Escherichia coli. The developed method utilizes the Mu in vitro transposition system to deliver both the E. coli origin of replication and a selectable marker into DNA-circles, which are then transformed into E. coli.  The method now enables the “rescuing” of circular DNA from very low target amounts, even in the presence of contaminating linear DNA fragments.

The basal level of transposition is typically low, as too excessive spread of elements could be detrimental to the host cell, and thus for the element itself. As low transposition frequency can severely complicate the applicational use of transposons, enhancing the transpositional activity has been one of the main targets in the art of transposon application development. In the last part of my thesis, I focused on generating hyperactive variants of MuA transposase. We showed that the hyperactive MuA variants improved the transposition efficiency of different Mu in vitro applications.

Transposons hold emerging potential for development of efficient and safe nonviral vectors for gene therapy. The hyperactive MuA variants generated in this study will improve the utility of MuA-based tools and can also promote the development of new gene therapy applications. Furthermore, the results with hyperactive MuA variants can be used for studies of other similar transposases or close relatives, such as HIV integrase, creating opportunities for accelerated progress in this field of research.

At the moment transposon-based technologies are widely used in bacterial and invertebrate models. However, current progress in transposon research indicates that, in the future, they will be more extensively used also for vertebrate models, in which the full potential of transposons as gene-delivery vehicles can be exploited.

Further reading:

 

Leave a Reply

Your email address will not be published. Required fields are marked *